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第1章 组培绪论思考题（无）

第2章 组培基本技术思考题

培养基中的主要成分有哪几类？（PPT23）

培养基的成分：水、无机成分、有机成分、天然有机添加物质、植物生长调节物质、培养基的pH值、凝固剂（琼脂）、活性炭、抗生素。

培养基中常添加的植物生长调节物质有哪两大类？各包括哪些常用种类？培养基中使用浓度范围？(PPT28、29)

培养基中常添加的植物生长调节物质有生长素类和细胞分裂素类这两大类

  • 生长素类常用种类有吲哆乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哆丁酸（IBA），萘乙酸（NAA）。培养基中常用浓度：0.1~10mg/L
  • 细胞分裂素类常用种类有6-BA，激动素（KT），异戊烯基腺嘌呤（2-ip） ，噻重氮苯基脲（TDZ），玉米素（Zt）， 6-苄基腺嘌呤（BAP）。培养基中常用浓度： 0.1~10mg/L

培养基中经常加入的生长素类和细胞分裂素类物质各有何作用？这两类激素的使用规律如何？

  • 生长素类主要被用于诱导愈伤组织形成；诱导根的分化和促进细胞分裂，伸长生长。
  • 细胞分裂素类促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成，延缓组织的衰老和蛋白质的合成

根和芽的分化由细胞分裂素和生长素的比值所决定：二者比值低时促进生根；比值高时促进茎芽的分化；比值适中则组织倾向于以一种无结构的方式生长。

母液配制流程？（PPT40）

计算 → 称量 → 加成分溶解 → 混合定容 → 测pH → 贴标签 → 冰箱贮存

选择外植体需要注意哪些方面（PPT50）

  1. 选择优良的基因型。基因型是控制愈伤组织形态建成的关键。不同物种的外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同，如烟草、胡萝卜、苜蓿等较易发生器官分化，而禾本科（禾谷类）、豆类、棉花等的愈伤组织形态建成相对较难。 同属不同种，甚至同一物种不同品种的愈伤组织器官分化的能力也不同。根据目的，选择优良的基因型，提高成功率。
  2. 外植体的增殖能力。不同组织细胞的脱分化能力不同。
  3. 外植体大小。胚胎培养或脱毒，外植体宜小； 若快速繁殖，外植体宜大；但过大杀菌不彻底，过小难以长活。一般在5~10mm为宜。
  4. 选择外植体的季节和时间。在生长季节取材，较幼嫩的外植体培养容易；秋冬季取材需要处理，夏季，雨季取材不容易灭菌成功。
  5. 外植体的生理状态和发育年龄。越幼嫩，年限越短的组织具有较高的形态发生能力；同株植物，较低部位外植体比上部的外植体容易启动，培养成功可能性大。

外植体污染原因？（PPT68）

  1. 外植体材料消毒不彻底
  2. 培养基灭菌不彻底
  3. 操作环境不洁净
  4. 操作人员操作不规范、不熟练。

污染的病原类型？（PPT68）

污染原因从病源方面主要有细菌和真菌两大类。造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。

  • 外部污染菌：主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。
  • 内源菌：外植体带菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理及消毒方法等密切相关。

防污染对策？（PPT69）

  1. 减少或防止材料带菌，取材时应选择嫩梢，新芽或胚作为外植体材料
  2. 外植体灭菌要彻底
  3. 培养基灭菌要彻底
  4. 玻璃器皿和金属器皿的灭菌要彻底
  5. 无菌室的消毒
  6. 操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。

常用消毒剂及外植体的消毒步骤？（PPT60、62）

常用消毒剂 使用浓度(%) 消毒时间(min) 效 果 残液去除难易
乙醇 70~75 0.1~3 好 易
氯化汞 0.1~1 2~15 最好 最难
次氯酸钙 10~20 5~30 好 易
次氯酸钠 2 5~30 好 易

外植体表面消毒的一般过程：

外植体取材 → 预处理 → 无菌条件下，70%~75%酒精表面消毒30s~60s → 无菌条件下，消毒剂处理 → 无菌水充分漂洗3~5次 → 备用

继代培养定义？（PPT84）

培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。

何为外植体的褐变，减轻外植体褐变的方法？（PPT87、90）

外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。

  • 它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶（PPO）被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。
  • 在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。

减轻褐变现象发生的方法：

  1. 选择合适的外植体。一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。
  2. 合适的培养条件。无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。
  3. 使用抗氧化剂。在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外，使用0.1%~0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。
  4. 连续转移。对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7~10d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

  1. 在培养室和操作室中，一年中要定期进行一两次熏蒸，使用的药品是：
    A、甲醛和高锰酸钾✔
    B、酒精和次氯酸钠
    C、紫外灯和酒精
    D、升汞和酒精

  2. 组织培养中常用的生长素：吲哆乙酸（IAA），2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哆丁酸（IBA），萘乙酸（NAA），它们的作用强弱顺序为 2,4-D > NAA > IBA > IAA 。

  3. 细胞分裂素中作用最强的是 TDZ 。

第3章 组培基本理论思考题

为什么利用植物的一个花瓣就可以培育出完整的植株？

细胞全能性

细胞为什么具有全能性？

生物的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成完整个体所必需的全部基因。

细胞表现出全能性的条件

  • 离体状态
  • 有一定营养物质、激素和其他外界条件（如无菌、温度、pH）

植物组织培养一般要经过哪两个的基本过程？

脱分化和再分化

决定细胞脱分化、再分化的关键因素是什么？

植物激素的种类和比例浓度。

愈伤组织的细胞有何特点？

排列疏松、高度液泡化的薄壁细胞

胚状体有何特点？

胚状体是由体细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。

  1. 当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。
  2. 一般情况下外植体越幼小，分化的程度就越低，组织培养的成功率就越高。
  3. 在一个生物体内，细胞没有表现出全能性，原因是:
    A、细胞失去了全能性
    B、细胞中的基因部分丢失
    C、细胞中的基因选择性表达✔
    D、细胞中的基因变异不同
  4. 关于愈伤组织形成过程的正确叙述是:
    A、愈伤组织的形成是离体植物细胞分化的结果
    B、愈伤组织的形成是离体植物细胞分裂的结果
    C、愈伤组织的形成是离体动物细胞分化的结果
    D、愈伤组织的形成是离体植物细胞脱分化的结果✔
  5. 当植物细胞脱离了原来所在植物体的器官或组织而处于离体状态时，下列有可能使其表现出全能性，发育成完整的植株的是:
    A、细胞分裂素
    B、生长素
    C、一定的营养物质
    D、以上三者均是✔
  6. 要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完整植株，不需要:
    A、具有完整细胞核的细胞
    B、离体状态
    C、导入外源基因✔
    D、一定的营养物质和激素
  7. 下列植物细胞全能性最高的是:
    A、形成层细胞✔
    B、韧皮部细胞
    C、木质部细胞
    D、叶肉细胞
  8. 下列细胞全能性最高的是:
    A、植物的卵细胞
    B、植物的精子细胞
    C、被子植物的受精卵✔
    D、被子植物的的叶肉细胞
  9. 绝大多数培养植物再生植株时都先经过 愈伤组织 阶段。
  10. 愈伤组织形成大致经历 诱导期 、分裂期 和 分化期 三个时期。
  11. 愈伤组织的形态发生方式主要有 不定芽和不定根 方式和 胚状体 方式。

某二倍体植物是杂合子,下图为其花药中未成熟花粉在适宜的培养基上培养产生完整植株的过程。据图回答：

  1. ①表示的是该花粉培养过程中的 脱分化 过程
  2. ②表示的是 再分化 过程,X代表的是 胚状体
  3. ③表示的是 分化（或发育） 过程
  4. ④表示的是诱导 生根 过程。

下图是植物组织培养的简略表示。据此回答：

  1. ①表示 离体的器官、组织或细胞 它能被培养成为④的根本原因是 植物细胞的全能性
  2. ②表示 愈伤组织 ，它与①相比分化程度 低 全能性 高 。
  3. 若想制作人工种子，应该选用（填编号） ③ 。
  4. 若①是胡萝卜根尖细胞，则培养成的④的叶片的颜色是 绿色 ，这说明根尖细胞 含有叶绿体形成相关的基因 。

第4章 植物组织器官形成思考题

愈伤组织形态发生（再分化过程）的两种方式（PPT4）

  • 体细胞发生途径（胚状体）
  • 器官发生途径（不定芽不定根）

器官发生再生植株的四种基本方式（PPT8）

  1. 愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根
  2. 先长芽，后长根，多数情况；
  3. 先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；
  4. 先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。

胚状体定义（PPT26）

体细胞胚又叫胚状体：指在组织培养中，由一个非合子细胞（体细胞），经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。

体细胞胚发生途径的特点（PPT33）

  1. 胚状体具有明显的两极性，即有茎端和根端；
  2. 存在生理隔离，即体细胞胚和外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态。
  3. 遗传的稳定性。
  4. 发生数量大，增殖率高。

影响体细胞胚胎发生的因素（PPT37~54、课本P53~55）

植物材料的内在因素

  1. 供体植物的基因型
    • 不同物种产生胚状体的能力不同
    • 同一物种的不同品种之间产生胚状体的能力也不同
  2. 外植体的来源
    • 大多数植物只有处于一定发育阶段的某一种器官的外植体能产生胚状体；
    • 芹菜、人参、葡萄、甘蔗的组织培养
    • 离体产生的胚状体可以再次作为外植体，经继代培养能够产生大量的次级和三级胚状体
    • 利用胚状体进行连续培养快速繁殖种苗
    • 在继代培养过程中，胚状体的发生能力会逐渐降低
    • 不同植物callus分化胚状体的速度不同
  3. 培养物的生理状况
    • 培养细胞的内源激素水平
    • 不同采样时期的外植体
    • 采用增殖能力较强的外植体
    • 获得较多的体细胞胚
  4. 培养物的倍性
    • 体细胞胚可以从不同倍性的组织中获得，单倍性的小孢子（花粉）；二倍体、三倍体、多倍体体细胞
    • 倍性水平不影响体细胞胚的发生但体细胞胚的发育和转换过程会有差异

组织培养的外部因素

  1. 培养基中的外源激素

    • 根据不同植物对外源激素的需求分3种情况：①全过程不需要外源激素。添加少量会提高诱导频率；②诱导胚状体的全过程需要外源激素。较高的激动素和生长素的配比才有较高的频率(咖啡)；③前期需要激素，后期不需要或极低浓度即可。常见，激素诱导出后callus，诱导胚状体无需激素（或很低）
    • 不同植物的体胚发生，要求不同的激素种类（颠茄: NAA和激动素，南瓜：NAA和IBA）
    • 玉米素，一种天然的细胞分裂素，促进胡萝卜体胚的发生，猕猴桃的胚乳callus只有在培养基中添加玉米素才能分化出体胚

  2. 培养基成分对体胚形成的影响

    • 氮源：还原态的氮（铵盐）的浓度直接影响胚状体的诱导效果，培养基中添加有机氮源（水解酪蛋白、氨基酸）有利于胚状体的发生
    • 碳源：碳水化合物能维持组织培养中外植体的渗透压，同时又作为体胚发育的能源。其种类和浓度可以影响体胚的生长发育
    • 天然提取物：椰子乳被认为是对体胚发生最有效的物质；其它未成熟的胚乳，如玉米胚乳、水稻胚乳、小麦胚乳对胚的生长也有一定作用；酵母、麦芽、酪蛋白等提取物对促进体胚的产生和发育，都是较为有效的天然物质。
    • 活性炭：吸附一些外植体分泌出的有毒物质；提高体胚的诱导频率和生长发育

  3. 另外，一些其他因素如培养过程中的环境条件如光照、温度，对外植体的预处理如辐射、低温及离心等都会影响胚状体发发生。

第5章 胚胎培养思考题

为什么幼胚培养比成熟胚培养要求的培养基和培养条件更为严格？

成熟胚培养：指子叶期至发育成熟的胚培养。成熟胚是自养的，培养基需要简单。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。

幼胚培养：是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养；幼胚基本是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。

离体培养时胚的发育方式有哪几种？（PPT11）

离体胚培养：是指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术

  1. 合子胚发育途径：由合子形成球形胚，心形胚，鱼雷形胚，子叶形胚，形成完整的种子，合适条件下即可萌发成苗。
  2. 早熟萌发：幼胚离体培养不经历休眠过程，不经历胚胎发育迅速萌发成幼苗。多数情况一个幼胚萌发成一个植株，有时因细胞分裂形成许多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。苗弱小，不易成活。
  3. 脱分化形成愈伤组织：多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体或形成芽苗，主要原因是培养基成分不适宜。

胚胎培养在育种工作中有哪些应用（意义）？（PPT12）

  1. 用于的胚挽救，克服远缘杂种的不育性
  2. 使无生活力的种子获得后代
  3. 使发育不完全的植物获得后代
  4. 克服种子休眠、缩短育种年限
  5. 克服珠心胚的干扰
  6. 诱导胚状体及胚性愈伤组织
  7. 稀有植物的繁殖

离体授粉的类型和意义有哪些方面？（PPT55）

离体授粉的类型：

  • 离体胎座（胚珠）授粉：把花粉授于连在胎座的胚珠上，进而实现受精作用的方法
  • 离体子房授粉：将花粉粒直接送入子房以实现受精作用的方法。
  • 离体柱头（雌蕊）授粉：把花粉授于离体子房的柱头上，进而实现受精作用的方法

意义：

  1. 可以克服植物受精不育障碍，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。
  2. 克服自我不亲和性
  3. 诱导孤雌生殖
  4. 双受精及胚台早期发育的机理研究

第6章 人工种子思考题（无）

第7章 单倍体细胞培养思考题

说明植物花药培养和花粉培养概念（PPT21、32）

花药培养：将发育到一定阶段的花药剥离下来（切去花丝部分）接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。

花粉培养：是从花药中分离出来的花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而再分化并发育成完整植株的过程。

通过离体培养获得单倍体的途径有哪些？（课本P97）

花药培养、花粉（小孢子）培养和未受精子房及卵细胞培养，其中花药和小孢子培养是体外诱导单倍体的主要途径

花药培养中如何选择外植体？

选择花粉发育时期：单核早期到双核早期

花药培养与花粉培养有什么不同（或异同）？（PPT33）

相同点：培养目的相同，均获得单倍体植株。胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径。

不同点：

  1. 花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。
  2. 花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂

花药培养过程中花药为什么要经过低温处理？（课本P108）

对于有些物种，培养前对花药进行低温预处理，能显著提高培养效果。是成功的前提条件。

第8章 植物细胞培养及应用思考题（无）

第9章 植物体细胞杂交思考题（无）

第10章 植物脱毒技术思考题

某地区的一种马铃薯经多年的种植后，植株变的矮小，产量和品质都下降，怀疑是由病毒所至。请你设计一个病毒的鉴定和脱毒的技术方案

脱毒植物的鉴定方法：

  1. 直接鉴定法：观察脱毒后植株茎、叶等器官生长情况，有无病毒引起的症状。
  2. 指示植物鉴定：对病毒反应敏感、症状明显的植物。如烟草、马铃薯、葡萄、柑桔等。方法①摩擦接种法：用脱毒植物叶片中汁液与金刚砂或石英沙摩擦指示植物叶片，冲冼培养数天，观察有无出现病毒感染症状。方法②嫁接法：木本植物病毒不通过汁液传播。将脱毒植物茎尖微嫁接在指示植物砧木上，观察有无出现病毒感染症状。
  3. 电镜检测：电镜下检测病毒形态、大小及结构。
  4. 抗血清检测法：病毒蛋白抗原免疫动物，获得含特异结合抗体的血清，再与脱毒植物是否发生血清反应检测。酶联免疫吸附测定
  5. 分子检测技术：利用已知病毒DNA序列设计引物或探针，检测脱毒植物

脱毒的技术方案：

  1. 茎尖培养脱毒
  2. 热处理脱毒
  3. 茎尖与热处理相结合方法
  4. 其它途径脱毒：愈伤组织培养脱毒、茎尖微体嫁接、化学疗法脱毒（病毒抑制剂）

第11章 无性系变异及种质离体保存思考题

超低温保存离体种质资源的原理和一般程序是什么？（PPT34~35、38）

超低温保存：也叫冷冻保存，指在-196℃的液氮超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜条件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。

保存原理：低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。

基本程序：超低温保存的基本程序包括预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。

限制生长保存离体种质资源有哪些方式？

  • 常温限制生长保存
  • 低温保存
  • 超低温保存

细胞活力检测有哪些方法？（课本P258）

  • TTC法（氯化三苯基四氮唑还原法）
  • FDA染色法（二醋酸酯荧光素染色法）
  • 色谱分析法
  • 再培养
  • 细胞学变化
  • 生化稳定性
  • 遗传性分析

有哪些冷冻保护剂？（课本P249）

常见的防冻剂有二甲基亚砜（DMSO）、聚乙二醇（PEG）、甘油及多种糖类等

利用马铃薯无毒苗学习实践植物种质资源的限制生长保存技术

影响因素整理

影响器官分化的因素（课本P46、第4章PPT12）

  1. 培养基成分

    • 无机营养：培养基中的N，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重要作用。
    • 植物生长调节物质：培养基中生长调节物质对愈伤组织的诱导及增殖起着重要的调节作用。使用植物生长调节剂时，要注意种类和浓度，特别是生长素和细胞分裂素的比值。
    • 有机成分：培养基中加入糖、维生素类、肌醇和甘氨酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进器官分化。水解酪蛋白中含有多种氨基酸，助于器官分化。糖的种类和浓度对组织培养物的增殖和器官分化均有明显的影响。
    • 培养基pH值：培养基pH值影响愈伤组织对营养元素的吸收、呼吸代谢、多胺代谢、DNA合成以及植物激素对细胞的影响，从而影响愈伤组织的形成及形态建成。
    • 活性炭等一些惰性物质：活性炭有时会对愈伤组织的分化起到很好的作用，活性炭可促进愈伤组织的器官发生（根、芽）和体细胞胚胎发生。
    • 培养方式：有固体培养、液体培养等

  2. 环境条件

    • 光照：光照包括光强、光质和光周期，对器官分化有重要影响。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关，光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。
    • 温度：昼夜温差处理，低温处理
    • 湿度：培养室适宜的湿度为70%~80%

  3. 植株材料

    • 不同品种基因型的差异
    • 外植体的生理状况和外植体的类型：生长活跃的，幼嫩，自然繁殖的外植体利于培养

影响体细胞胚胎发生的因素（第4章PPT37~54）

植物材料的内在因素

  1. 供体植物的基因型
    • 不同物种产生胚状体的能力不同
    • 同一物种的不同品种之间产生胚状体的能力也不同
  2. 外植体的来源
    • 大多数植物只有处于一定发育阶段的某一种器官的外植体能产生胚状体；
    • 芹菜、人参、葡萄、甘蔗的组织培养
    • 离体产生的胚状体可以再次作为外植体，经继代培养能够产生大量的次级和三级胚状体
    • 利用胚状体进行连续培养快速繁殖种苗
    • 在继代培养过程中，胚状体的发生能力会逐渐降低
    • 不同植物callus分化胚状体的速度不同
  3. 培养物的生理状况
    • 培养细胞的内源激素水平
    • 不同采样时期的外植体
    • 采用增殖能力较强的外植体
    • 获得较多的体细胞胚
  4. 培养物的倍性
    • 体细胞胚可以从不同倍性的组织中获得，单倍性的小孢子（花粉）；二倍体、三倍体、多倍体体细胞
    • 倍性水平不影响体细胞胚的发生但体细胞胚的发育和转换过程会有差异

组织培养的外部因素

  1. 培养基中的外源激素

    • 根据不同植物对外源激素的需求分3种情况：①全过程不需要外源激素。添加少量会提高诱导频率；②诱导胚状体的全过程需要外源激素。较高的激动素和生长素的配比才有较高的频率(咖啡)；③前期需要激素，后期不需要或极低浓度即可。常见，激素诱导出后callus，诱导胚状体无需激素（或很低）
    • 不同植物的体胚发生，要求不同的激素种类（颠茄: NAA和激动素，南瓜：NAA和IBA）
    • 玉米素，一种天然的细胞分裂素，促进胡萝卜体胚的发生，猕猴桃的胚乳callus只有在培养基中添加玉米素才能分化出体胚

  2. 培养基成分对体胚形成的影响

    • 氮源：还原态的氮（铵盐）的浓度直接影响胚状体的诱导效果，培养基中添加有机氮源（水解酪蛋白、氨基酸）有利于胚状体的发生
    • 碳源：碳水化合物能维持组织培养中外植体的渗透压，同时又作为体胚发育的能源。其种类和浓度可以影响体胚的生长发育
    • 天然提取物：椰子乳被认为是对体胚发生最有效的物质；其它未成熟的胚乳，如玉米胚乳、水稻胚乳、小麦胚乳对胚的生长也有一定作用；酵母、麦芽、酪蛋白等提取物对促进体胚的产生和发育，都是较为有效的天然物质。
    • 活性炭：吸附一些外植体分泌出的有毒物质；提高体胚的诱导频率和生长发育

  3. 另外，一些其他因素如培养过程中的环境条件如光照、温度，对外植体的预处理如辐射、低温及离心等都会影响胚状体发发生。

影响离体授粉的因素（课本P63）

  1. 外植体的发育阶段
  2. 花粉粒数量及萌发力
  3. 营养及环境条件
  4. 授粉方式
  5. 保留母体组织的影响
  6. 基因型的影响
  7. 培养前的预处理

影响花药培养的因素

课本P105

  1. 植株的生长条件

  2. 供体植株的年龄

  3. 花粉发育时期

  4. 花蕾和花药的预处理

  5. 供体植株的基因型

  6. 培养基

    • 基本培养基
    • 碳源
    • 激素成分
    • 氮源
    • 硝酸银
    • 其他成分
    • pH值

  7. 培养条件

  8. 活性炭的作用

第7章PPT30

  1. 供体植株的基因型：不同种和品种的花药，在离体培养条件下的反应能力有明显差异。
  2. 花粉发育时期：花粉的发育时期使诱导小孢子分裂的关键，多数植物在单核中期至单核晚期（单核靠边期）的花粉都易形成花粉愈伤组织或花粉胚。
  3. 花药的生理状态：适宜条件下的健康植株，花药培养的胚诱导率，再生率高，冬春季较夏秋季适合花药培养；多数情况下，幼年植株优于老年植株。
  4. 花蕾和花药的预处理：预处理是小孢子培养成功的前提条件。有低温，高温及甘露醇等预处理，其中以低温预处理应用最广。
  5. 培养基的影响：基本培养基是花药培养中影响花粉启动和再分化的重要条件，不仅决定花药培养的成功，还决定着雄核发育的方式。培养基因植物种类的不同而异。
    • 多采用MS培养基
    • 对氨态氮和硝态氮比例加以调整
    • 植物生长调节剂为大多数的雄核发育所必需，常诱发细胞的分裂，生长和分化。
    • 所需蔗糖的浓度在3%-10%
    • pH值有一定的要求

影响花药培养和花粉培养的因素（第7章PPT42）

  1. 基因型：不同基因型的培养难易及植株再生有很大差别。
  2. 植株的生理状态和环境条件：母体植株的年龄和所经历的环境条件如：光周期、光照强度、温度等对以后的花粉离体培养有很大影响。一般田间比温室，幼龄比老龄植株易于培养。
  3. 花粉的发育时期：多数植物单核期的花粉培养容易成功。
  4. 培养基：基因型不同，所需培养基种类，蔗糖浓度以及添加激素种类和浓度不同

影响花粉(小孢子)培养的因素（课本P118）

很大程度上与影响花药培养效果的因素相类似

  1. 合适的基因型分离小孢子是培养成功的关键因素
  2. 外植体的生理状态对游离花粉的分裂能力有重要影响
  3. 一定条件下预培养后的花药分离出的花粉在进行培养容易收到良好的效果
  4. 培养基的成分当然影响花粉的培养效果
  5. 培养基的物理状态与培养效果有关
  6. 良好的培养与再生效果需要多种因素综合改进使用

影响单细胞培养的因素（课本P128）

培养基的成分和细胞植板密度是单细胞培养成败的关键，这两个因子是相互依赖的。

影响细胞悬浮培养的因素（课本P136）

  1. 基本培养基的组成
  2. 有机成分
  3. 碳源
  4. 植物激素
  5. 培养基的pH值及渗透压
  6. 振荡频率
  7. 培养条件

影响幼胚培养成功的因素（第5章PPT25）

  1. 基本培养基+附加物

    • 无机盐，成熟胚培养基简单，如White.幼胚培养有MS，B5等，可使K+,Ca2+水平稍高。
    • 碳水化合物，糖的作用：调节渗透压；碳源；防止幼胚早萌。渗透压：提高培养基渗透压是防止早熟萌发的有效方法。最适蔗糖浓度随着胚的发育时期二降低。提高渗透压的方法：提高糖浓度，提高无机盐浓度，加入甘露醇。

  2. 激素的作用

    • 成熟胚一般不需要外源激素即可萌发。单激素能促进休眠胚的 萌发。
    • 幼胚需要外源激素，应保持外源激素与内源激素的平衡。过低不能促进生长，过高易导致幼胚脱分化形成愈伤。

  3. 天然提取物及某些蛋白制品：促进幼胚的发育

  4. 环境条件

    • 温度：多数为25~30℃；
    • 光照：一般认为黑暗或弱光条件较为合适。

  5. 提高幼胚的成活萌发的有效率，可采用胚乳看护培养

有关流程整理

外植体表面消毒的一般过程（第2章PPT62、课本P34）

外植体表面消毒的一般过程：

外植体取材 → 预处理 → 无菌条件下，70%~75%酒精表面消毒30s~60s → 无菌条件下，消毒剂处理 → 无菌水充分漂洗3~5次 → 备用

配置母液流程（第2章PPT40）

计算 → 称量 → 加成分溶解 → 混合定容 → 测pH → 贴标签 → 冰箱贮存

培养基的配制流程（第2章PPT43）

准备 → 将水、母液和糖混合定容 → 调pH → 加入琼脂 → 加热溶解 → 分装到已经清洗干燥的培养器皿中 → 封口 → 标记 → 高压蒸汽灭菌 → 冷却 → 凝固 → 接种

外植体接种步骤（第2章PPT74）

切割外植体 → 培养瓶倾斜靠近酒精灯火焰 → 瓶盖外部在火焰上旋转灼烧数秒钟 → 旋开瓶盖，放在酒精灯旁边 → 瓶口在火焰上旋转灼烧数秒钟 → 用无菌镊子将外植体均匀放置在培养基上 → 瓶盖在火焰上灼烧两圈 → 盖紧瓶盖

茎尖脱毒培育程序（课本P76）

采样 → 取外叶 → 剥离茎尖 → 切取分生组织 → 茎尖培养 → 茎尖再生植株 → 病毒鉴定 → 防虫网内繁殖脱毒苗

花药培养的基本程序（第7章PPT23）

培养材料的选择 → 材料（花蕾）预处理 → 外植体消毒灭菌 → 接种培养 → 植株再生 → 诱导生根 → 单倍体植株的染色体加倍及驯化移栽。

花粉培养的基本程序（第7章PPT35）

取花蕾（镜检） → 消毒 → 取花药 → 预培养数天 → 分离花粉 → 接种 → 培养 → 胚状体或愈伤组织发生

成熟胚培养过程（第5章PPT21）

选取完好种子 → 70%酒精浸数秒 → 0.1%升汞或2%次氯酸钠浸泡 → 无菌水冲洗 → 种子培养几天 → 剥离种胚 → 接种在培养基上。

幼胚培养的基本程序（第5章PPT22）

取子房 → 常规表面消毒 → 解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚 → 固体培养

超低温保存的基本程序（第11章PPT38）

超低温保存的基本程序包括预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻和再培养。

预处理：为保证茎尖在液N2处理后具有稳定且高的存活率，需进行一定的预处理，或在冷冻防护剂存在下进行预培养，或直接进行低温（-3~10℃）预处理。

植物组织培养一般过程（第3章PPT64）

初代培养 → 继代培养 → 丛芽培养 → 生根培养 → 驯化培养

计算题培养基的配置

母液配制注意的问题：

  1. 几种试剂混合配制时要按一定顺序将各种溶液混合。
  2. 在配制母液时应注意防止产生沉淀,如Ca2+和SO42+ , Ca2+、Mg2+和PO42+ 一起溶解后,会产生沉淀。
  3. 应采用纯度等级较高的分析纯或化学纯。
  4. 要用纯度较高的蒸馏水或去离子水。
  5. 母液一旦出现沉淀或有可见微生物的污染，应立即停止使用，重新配制。

母液吸取体积计算公式：

所需母液的体积=所需要培养基的体积/母液的浓缩倍数

重点知识点整理

  1. 培养基的成分：水、无机成分、有机成分、天然有机添加物质、植物生长调节物质、培养基的pH值、凝固剂–琼脂、活性炭、抗生素。
  2. 无机成分中大量元素化合物指浓度>0.5mmol/L，有N、P、K、Ca、Mg、S。
  3. 无机成分中微量元素化合物指浓度<0.5mmol/L，有B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co、Cl、Fe
  4. 铁盐容易发生沉淀，需要单独配制，一般与Na2EDTA相互配
  5. 培养基中糖类的功能：碳源及维持培养基一定的渗透压，蔗糖是最好的碳源，葡萄糖和果糖次之。
  6. 培养基中氨基酸类的功能：蛋白质组成，优质有机氮源，促进细胞生长分化
  7. 生长素类、细胞分裂素类的作用、常用种类、强弱顺序
  8. 培养基的pH值：灭菌前pH值调控范围：pH=5.0~6.0。pH对培养基凝固的影响：高6.0会变硬，低于5.0凝固效果不好。pH调节剂：HCl、NaOH
  9. 凝固剂–琼脂,用量范围：0.4%~1.0%，影响琼脂凝固的因素：厂家的加工方式；灭菌的时间，温度，pH值；存放的时间
  10. 抗生素不耐高温，需单独过滤灭菌。作用：防止外植体内生菌造成的污染。
  11. 基本培养基较于完全培养基不包括激素和天然有机附加物。
  12. 高无机盐含量的培养基代表类型：MS培养基、ER培养基
  13. 硝酸钾含量较高的培养基代表类型：B5、N6
  14. 干热灭菌（如烘烤和灼烧）；湿热灭菌（如常压或高压蒸煮）；过滤灭菌（如空气过滤和液体过滤）
  15. 高温高压蒸气灭菌温度：121°C；1.1~1.2kg/cm2，压力不要超过0.15MP，维持15~20分钟即可关闭电源。
  16. 过滤灭菌：用于高温高压下易分解的培养基和激素类
  17. 细胞全能性理论：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。
  18. 植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱:营养生长中心 > 形成层 > 薄壁细胞 > 厚壁细胞(木质化细胞) > 特化细胞(筛管、导管细胞)
  19. 植物细胞全能性表达的条件：①体细胞与完整植株分离，脱离完整植株的控制；②创造理想的适于细胞生长和分化的环境（主要是激素的作用）
  20. 细胞实现全能性的过程：通过脱分化和再分化两个阶段。
  21. 液泡消失和叶绿体的转变是脱分化的重要特征。
  22. 根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段：启动阶段、演变阶段和脱分化终结期
  23. 脱分化的关键植物激素
  24. 脱分化细胞特点：细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。
  25. 愈伤组织的定义：在组织培养过程中，沿用了这一名称，实际上是指外植体在离体培养条件下，形成的一团没有分化、又能旺盛分裂的薄壁细胞团，是组织培养过程中经常出现的一种组织状态。
  26. 愈伤组织的产生原因：内因：内源激素，材料被切伤后分泌的伤源激素；外因：外源生长调节剂，人为在培养基内加入激素。
  27. 从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期和分化期
  28. 两种愈伤组织间的转化关系：坚实型升高生长素浓度转化成松脆型，松脆型降低或去除生长素转化成松脆型
  29. 优良的愈伤组织通常具备以下4个特性：①高度的胚性或再分化能力。②容易散碎，建立优良的悬浮系，并能分离出全能性原生质体。③旺盛的自我增殖能力。④经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。
  30. 愈伤组织的形态发生：愈伤组织在适宜的培养条件下发生再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。
  31. 愈伤组织形态发生形成完整植株的途径：体细胞发生途径（胚状体）、器官发生途径（不定芽不定根）
  32. 器官发生的途径有两种：直接途径：不经愈伤组织阶段直接分化器官；间接途径：经过愈伤组织阶段
  33. 愈伤组织通过不定芽方式再分化成完整植株的的方式主要有四种(器官发生再生植株的基本方式)：①愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；②先长芽，后长根，多数情况；③先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；④先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。
  34. 影响器官分化的因素（要点，详见影响因素）
  35. 体细胞胚又叫胚状体：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。
  36. 体细胞胚发生的途径：直接形成胚胎指在外植体上直接分化出胚状体，大多数外植体为子叶和下轴胚最易诱导体细胞胚发生。间接形成胚胎是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体
  37. 体细胞胚发生途径的特点:①胚状体具有明显的两极性，即有茎端和根端；存在生理隔离，即体细胞胚和外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态。②遗传的稳定性。③发生数量大，增殖率高。
  38. 影响体细胞胚胎发生的因素（重点，详见影响因素）
  39. 胚培养：是将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成熟胚(原胚)和成熟胚两种类型的离体培养。
  40. 胚发育可分为异养和自养两个阶段。
  41. 胚培养的意义
  42. 依据所剥离胚的发育时期不同：分为两种培养类型幼胚培养（子叶形成前）和成熟胚培养（子叶形成后）
  43. 幼胚培养：是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养；幼胚基本是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
  44. 幼胚的分离及培养：幼胚剥离是关键。
  45. 影响幼胚培养成功的因素（要点，详见影响因素）
  46. 胚乳培养（Endosperm culture）：是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
  47. 胚乳离体培养的意义
  48. 带胚培养胚乳组织容易成功，不带胚培养胚乳组织成功率低
  49. 根据细胞分化特点，胚乳发育可分为以下3类：核型胚乳、细胞型胚乳、沼生目型胚乳
  50. 胚乳培养的关键技术，胚乳发育时期中游离核型期难以培养，细胞型期易培养成功
  51. 离体授粉：指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。
  52. 离体授粉的类型：离体胎座（胚珠）授粉、离体子房授粉、离体柱头（雌蕊）授粉
  53. 离体子房授粉的方法：直接引入法、注射法
  54. 离体授粉的目的：克服受精前障碍
  55. 人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体(体胚)或者能发育成完整植株的分生组织(不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等)包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。
  56. 人工种子的结构：最外面一层是人工种皮，中间是人工胚乳，种子内面则是被包埋的胚状体或类似物
  57. 人工种子的包埋技术最佳的凝胶包埋材料是藻酸盐，包埋方法有滴注法和装模法。（课本P67）
  58. 单倍体（Haploid）：指具有配子体（gametophyte）染色体数的个体或组织，即体细胞染色体数为n。 单倍体不等于一倍体。把只有一个染色体组的细胞或体细胞中只含有单个染色体组的个体称为一倍体。由合子发育来的个体，细胞中含有几个染色体组，就叫几倍体;而由配子直接发育来的,不管含有几个染色组，都只能叫单倍体，
  59. 单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点：体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小； 雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。
  60. 植物单倍体细胞培养方法：胚珠或子房培养（未受精）、花药培养、花粉培养
  61. 花药培养：将发育到一定阶段的花药剥离下来(切去花丝部分)接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。
  62. 花药培养的基本程序（详见有关程序）
  63. 花药培养材料的选择：花粉发育时期为单核早期到双核早期
  64. 压片染色法：花药在接种以前，一般需先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。（第7章PPT25、课本P107）
  65. 花药培养材料的预处理是小孢子培养成功的前提条件。
  66. 影响花药培养效率的因素：供体植株的基因型；花粉发育时期；花药的生理状态；花蕾和花药的预处理；培养基的影响
  67. 花粉培养的概念：是从花药中分离出来的花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而再分化并发育成完整植株的过程。
  68. 花药培养与花粉培养的异同
  69. 花粉的分离的3个方法：自然散落法、挤压法、机械游离
  70. 单倍体育种：指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原理材料。
  71. 由完整的植物器官分离单细胞：叶片是分离单细胞的最好材料
  72. 植物单细胞的分离的方法：机械法、酶解法
  73. 酶解法：指用专一的水解酶（纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。
  74. 植物单细胞培养的方法：平板培养、看护培养、微室培养、纸桥培养、饲养层培养法
  75. 悬浮细胞培养的同步化：①物理方法：体积选择法、低温休克法；②化学法：饥饿法；抑制法；不连续密度梯度离心法
  76. 生物反应器的类型：搅拌式反应器、气动式反应器、固定化反应器
  77. 固定化细胞活力测定：①荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。②呼吸强度测定：用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。③细胞分解和生长速率的测定：通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。
  78. 在幼胚培养中，蔗糖是效果最好的碳源之一，同时又起调节渗透压的主要作用，这一点对幼胚尤其重要。（课本P58）
  79. 对于体细胞发生的同步化控制和纯化筛选的方法有化学抑制法、低温抑制法、渗透压选择法、机械过筛选择法、应用植物胚性细胞分级仪。（课本P67）
  80. 原生质体：除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体
  81. 原生质体的分离方法：机械分离法、酶解分离法（纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等）
  82. 原生质体的纯化方法：沉降法、漂浮法、界面法
  83. 原生质体活力的测定：目测法：形态识别；荧光素双醋酸酯(FDA)染色法（FDA本身不发荧光，也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶分解，形成有荧光的极性物质（荧光素）。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。活细胞被染色）；染色法，酚藏花红染色法（0.01%）（无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。）、伊凡蓝(Evan’s blue)染色法（0.025%）（有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料，活细胞不摄取，无色；无活力的细胞吸收染料为蓝色。）
  84. 细胞杂种的鉴定：①杂种植物形态特征、特性鉴定；②杂种植物的核型分析；③同工酶分析；④分子标记鉴定：RFLP、RAPD、SSR标记鉴定
  85. 无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。
  86. 茎尖脱毒一般切取0.2~0.3mm，带1~2个叶原基的茎尖作为培养材料较好。
  87. 热处理去除病毒的原因：利用某些病毒受热以后的不稳定性，而使病毒钝化，失去活性。（课本P75）
  88. 去除植物病毒的方法有热处理法、微茎尖培养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法等。
  89. 茎尖微体嫁接：木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4~1mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。
  90. 脱毒植物的鉴定方法：直接鉴定法、指示植物鉴定、抗血清反应鉴定、分子检测、电镜检测
  91. 无病毒苗的保存繁殖：隔离保存、长期保存
  92. 无毒苗的鉴定方法主要有：①指示植物鉴定法；②抗血清鉴定法；③电子显微镜检查法；④酶联免疫鉴定法。其中，最后一种是目前比较精确和常用的鉴定方法。多次监测，有延时性
  93. 体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones）。
  94. 在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象，称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。
  95. 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。
  96. 影响体细胞遗传与变异的因素：培养基和培养方式、继代培养的次数
  97. 体细胞变异的细胞遗传学基础：染色体数量和结构的改变
  98. 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。
  99. 种质：是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。
  100. 植物种质资源：即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。
  101. 种质资源保存：是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。
  102. 植物种质离体保存的方法：常温限制生长、低温保存、超低温保存
  103. 低温保存：温度（非冰冻低温，一般为1~9℃）；超低温保存：-196℃的液氮
  104. 超低温保存的原理：植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。
  105. 冷冻防护剂：常见的防冻剂有二甲基亚砜（DMSO）、聚乙二醇（PEG）、甘油及多种糖类等，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。
  106. 冷冻保护剂应具有以下特性：分子质量较小、易于与溶剂混合、快速渗入细胞；无毒或毒性小、易洗脱。常用的是DMSO。

重点知识点自测

  1. 培养基的成分： 水 、 无机成分 、 有机成分 、 天然有机添加物质 、 植物生长调节物质 、 培养基的pH值 、 凝固剂--琼脂 、 活性炭 、 抗生素 。
  2. 无机成分中大量元素化合物指浓度 大于0.5mmol/L ，有 N、P、K、Ca、Mg、S 。
  3. 无机成分中微量元素化合物指浓度 小于0.5mmol/L ，有 B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co、Cl、Fe 。
  4. 铁盐容易发生沉淀，需要 单独配制 ，一般与 Na2EDTA 相互配
  5. 培养基中糖类的功能：碳源及维持培养基一定的 渗透压 ，蔗糖是最好的碳源，葡萄糖和果糖次之。
  6. 培养基中氨基酸类的功能：蛋白质组成，优质有机 氮源 ，促进细胞生长分化
  7. 生长素类、细胞分裂素类的作用、常用种类、强弱顺序
  8. 培养基的pH值：灭菌前pH值调控范围：pH= 5.0\~6.0 。pH对培养基凝固的影响：高6.0会变 硬 ，低于5.0凝固 效果不好 。pH调节剂：HCl、NaOH
  9. 凝固剂–琼脂,用量范围： 0.4%\~1.0% ，影响琼脂凝固的因素：厂家的加工方式；灭菌的时间，温度，pH值；存放的时间
  10. 抗生素不耐高温，需单独 过滤 灭菌。作用：防止外植体内生菌造成的污染。
  11. 基本培养基较于完全培养基 不包括激素和天然有机附加物 。
  12. 高无机盐含量的培养基代表类型： MS培养基 、 ER培养基 。
  13. 硝酸钾含量较高的培养基代表类型： B5 、 N6 。
  14. 干热灭菌（如烘烤和灼烧）；湿热灭菌（如常压或高压蒸煮）；过滤灭菌（如空气过滤和液体过滤）
  15. 高温高压蒸气灭菌温度： 121 °C； 1.1\~1.2 kg/cm2，压力不要超过 0.15 MP，维持 15-20 分钟即可关闭电源。
  16. 过滤灭菌：在高温高压下易分解的培养基和激素类
  17. 细胞全能性理论： 植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力 。
  18. 植物细胞全能性表现根据细胞类型不同从强到弱: 营养生长中心 > 形成层 > 薄壁细胞 > 厚壁细胞(木质化细胞) > 特化细胞(筛管、导管细胞) 。
  19. 植物细胞全能性表达的条件：① 体细胞与完整植株分离，脱离完整植株的控制 ；② 创造理想的适于细胞生长和分化的环境（主要是激素的作用）
  20. 细胞实现全能性的过程：通过 脱分化 和 再分化 两个阶段。
  21. 液泡消失 和 叶绿体的转变 是脱分化的重要特征。
  22. 根据脱分化细胞过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段： 启动阶段 、 演变阶段 和 脱分化终结期 。
  23. 脱分化的关键 植物激素 。
  24. 脱分化细胞特点： 细胞质显著变浓，大液泡消失，核体积增加并逐渐移位至细胞中央，细胞器增加。
  25. 愈伤组织的定义： 在组织培养过程中，沿用了这一名称，实际上是指外植体在离体培养条件下，形成的一团没有分化、又能旺盛分裂的薄壁细胞团，是组织培养过程中经常出现的一种组织状态。 。
  26. 愈伤组织的产生原因：内因： 内源激素，材料被切伤后分泌的伤源激素 ；外因： 外源生长调节剂，人为在培养基内加入激素。 。
  27. 从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期： 诱导期 、 分裂期 和 分化期
  28. 两种愈伤组织间的转化关系：坚实型 升高生长素浓度 转化成松脆型，松脆型 降低或去除生长素 转化成松脆型
  29. 优良的愈伤组织通常具备以下4个特性：① 高度的胚性或再分化能力 。② 容易散碎，建立优良的悬浮系，并能分离出全能性原生质体 。③ 旺盛的自我增殖能力 。④ 经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作 。
  30. 愈伤组织的形态发生：愈伤组织在适宜的培养条件下发生再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。
  31. 愈伤组织形态发生形成完整植株的途径： 体细胞发生途径（胚状体） 、 器官发生途径（不定芽不定根） 。
  32. 器官发生的途径有两种： 直接途径：不经愈伤组织阶段直接分化器官 ； 间接途径：经过愈伤组织阶段 。
  33. 愈伤组织通过不定芽方式再分化成完整植株的的方式主要有四种(器官发生再生植株的基本方式)：① 愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根 ；② 先长芽，后长根，多数情况 ；③ 先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物 ；④ 先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株 。
  34. 影响器官分化的因素（要点，详见影响因素）
  35. 体细胞胚又叫胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过 原胚 、 球形胚 、 心形胚 、 鱼雷胚 和 子叶 胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。
  36. 体细胞胚发生的途径： 直接形成胚胎指在外植体上直接分化出胚状体，大多数外植体为子叶和下轴胚最易诱导体细胞胚发生 。 间接形成胚胎是指在外植体上先分化出胚性愈伤组织，然后由胚性愈伤组织再分化形成胚状体 。
  37. 体细胞胚发生途径的特点:① 胚状体具有明显的两极性，即有茎端和根端；存在生理隔离，即体细胞胚和外植体的维管束系统无直接联系，胚状体与周围组织间形成缝隙，处于较独立的状态 。② 遗传的稳定性 。③ 发生数量大，增殖率高 。
  38. 影响体细胞胚胎发生的因素（重点，详见影响因素）
  39. 胚培养： 是将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成熟胚(原胚)和成熟胚两种类型的离体培养。
  40. 胚发育可分为 异养 和 自养 两个阶段。
  41. 胚培养的意义
  42. 依据所剥离胚的发育时期不同：分为两种培养类型 幼胚培养 （子叶形成前）和 成熟胚培养 （子叶形成后）
  43. 幼胚培养： 是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养 ；幼胚基本是 异养的 ，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
  44. 幼胚的分离及培养： 幼胚剥离 是关键。
  45. 影响幼胚培养成功的因素（要点，详见影响因素）
  46. 胚乳培养（Endosperm culture）： 是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。
  47. 胚乳离体培养的意义
  48. 带胚 培养胚乳组织容易成功， 不带胚 培养胚乳组织成功率低
  49. 根据细胞分化特点，胚乳发育可分为以下3类： 核型胚乳 、 细胞型胚乳 、 沼生目型胚乳
  50. 胚乳培养的关键技术，胚乳发育时期中 游离核型期 难以培养， 细胞型期 易培养成功
  51. 离体授粉： 指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。
  52. 离体授粉的类型： 离体胎座（胚珠）授粉 、 离体子房授粉 、 离体柱头（雌蕊）授粉
  53. 离体子房授粉的方法： 直接引入法 、 注射法
  54. 离体授粉的目的： 克服受精前障碍
  55. 人工种子： 将植物离体培养中产生的胚状体(体胚)或者能发育成完整植株的分生组织(不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等)包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。
  56. 人工种子的结构：最外面一层是 人工种皮 ，中间是 人工胚乳 ，种子内面则是被包埋的 胚状体 或类似物
  57. 人工种子的包埋技术最佳的凝胶包埋材料是 藻酸盐 ，包埋方法有 滴注法 和 装模法 。（课本P67）
  58. 单倍体（Haploid）： 指具有配子体（gametophyte）染色体数的个体或组织，即体细胞染色体数为n。 单倍体不等于一倍体 。把只有一个染色体组的细胞或体细胞中只含有单个染色体组的个体称为一倍体。由合子发育来的个体，细胞中含有几个染色体组，就叫几倍体;而由配子直接发育来的,不管含有几个染色组，都只能叫单倍体，
  59. 单倍体植物与二倍体相比较，有三个明显的特点：体细胞染色体数 减半 ；生长发育 弱 ，体形 小 、各器官明显 减小 ； 雌雄配子严重 败育 ，有的甚至不能进入有性世代。
  60. 植物单倍体细胞培养方法: 胚珠或子房培养（未受精） 、 花药培养 、 花粉培养
  61. 花药培养： 将发育到一定阶段的花药剥离下来(切去花丝部分)接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。
  62. 花药培养的基本程序（详见有关程序）
  63. 花药培养材料的选择：花粉发育时期为 单核早期到双核早期
  64. 压片染色法：花药在接种以前，一般需先用 醋酸洋红 压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。（第7章PPT25、课本P107）
  65. 花药培养材料的 预处理 是小孢子培养成功的前提条件。
  66. 影响花药培养效率的因素： 供体植株的基因型 ； 花粉发育时期 ； 花药的生理状态 ； 花蕾和花药的预处理 ； 培养基的影响
  67. 花粉培养的概念： 是从花药中分离出来的花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而再分化并发育成完整植株的过程。
  68. 花药培养与花粉培养的异同
  69. 花粉的分离的3个方法： 自然散落法 、 挤压法 、 机械游离
  70. 单倍体育种： 指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原理材料。
  71. 由完整的植物器官分离单细胞： 叶片 是分离单细胞的最好材料
  72. 植物单细胞的分离的方法： 机械法 、 酶解法
  73. 酶解法：指用专一的水解酶（纤维素酶 、 果胶酶 、 琼脂酶 等）在温和条件下分解胞间层，分离细胞。
  74. 植物单细胞培养的方法： 平板培养 、 看护培养 、 微室培养 、 纸桥培养 、 饲养层培养法
  75. 悬浮细胞培养的同步化：① 物理方法：体积选择法、低温休克法 ；② 化学法：饥饿法；抑制法；不连续密度梯度离心法
  76. 生物反应器的类型： 搅拌式反应器 、 气动式反应器 、 固定化反应器
  77. 固定化细胞活力测定：① 荧光染色观察法：根据活细胞对FDA（二乙酸荧光素）黄绿色荧光染料能被吸收，而死细胞无法吸收原理鉴定。 ② 呼吸强度测定：用氧电极法测定固定化细胞的呼吸强度判断存活率。③细胞分解和生长速率的测定：通过测定细胞的湿重或干重增加率反映细胞活性大小。
  78. 在幼胚培养中，蔗糖是效果最好的碳源之一，同时又起 调节渗透压 的主要作用，这一点对幼胚尤其重要。（课本P58）
  79. 对于体细胞发生的同步化控制和纯化筛选的方法有 化学抑制法 、 低温抑制法 、 渗透压选择法 、 机械过筛选择法 、 应用植物胚性细胞分级仪 。（课本P67）
  80. 原生质体： 除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体
  81. 原生质体的分离方法： 机械分离法 、 酶解分离法 （ 纤维素 酶、 半纤维素 酶、 果胶 酶、 果酸 酶等）
  82. 原生质体的纯化方法： 沉降法 、 漂浮法 、 界面法
  83. 原生质体活力的测定： 目测 法：形态识别； 荧光素双醋酸酯(FDA)染色 法（FDA本身不发荧光，也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被酯酶分解，形成有荧光的极性物质（荧光素）。荧光素则不能自由穿越质膜，在完整的活细胞内积累。活细胞被染色）； 染色 法，酚藏花红染色法（0.01%)、伊凡蓝(Evan’s blue)染色法(0.025%)
  84. 细胞杂种的鉴定：① 杂种植物形态特征、特性鉴定 ；② 杂种植物的核型分析 ；③ 同工酶分析 ；④ 分子标记鉴定：RFLP、RAPD、SSR标记鉴定
  85. 无病毒苗： 指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木。
  86. 茎尖脱毒一般切取 0.2\~0.3mm ，带1~2个叶原基的茎尖作为培养材料较好。
  87. 热处理去除病毒的原因：利用某些病毒受 热以后的不稳定性 ，而使病毒钝化，失去活性。（课本P75）
  88. 去除植物病毒的方法有 热处理法 、 微茎尖培养法 、 愈伤组织培养法 和 茎尖微体嫁接法 等。
  89. 茎尖微体嫁接： 木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4\~1mm茎尖，在砧木上进行试管微体嫁接，以获得无病毒幼苗。
  90. 脱毒植物的鉴定方法： 直接鉴定法 、 指示植物鉴定 、 抗血清反应鉴定 、 分子检测 、 电镜检测
  91. 无病毒苗的保存繁殖： 隔离保存 、 长期保存
  92. 无毒苗的鉴定方法主要有：① 指示植物鉴定法 ；② 抗血清鉴定法 ；③ 电子显微镜检查法 ；④ 酶联免疫鉴定法 。其中，最后一种是目前比较精确和常用的鉴定方法。
  93. 体细胞无性系： 由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系（somaclones）。
  94. 在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象 ，称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）。
  95. 嵌合性是指 同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象。
  96. 影响体细胞遗传与变异的因素： 培养基和培养方式 、 继代培养的次数
  97. 体细胞变异的细胞遗传学基础： 染色体数量和结构的改变
  98. 染色体结构变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培养中染色体结构变异的主要原因之一，也是体细胞变异中经常发生的现象，其细胞学特征是 分裂中期出现断裂的染色体片段 、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的结构变异。
  99. 种质：是 亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。 。
  100. 植物种质资源：即为 携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。
  101. 种质资源保存：是指 在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。
  102. 植物种质离体保存的方法： 常温限制生长 、 低温保存 、 超低温保存
  103. 低温保存：温度（ 非冰冻低温，一般为1-9℃ ）；超低温保存： -196℃的液氮
  104. 超低温保存的原理： 植物材料在超低温条件下，冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分次生结冰而达到植物材料保存目的。
  105. 冷冻防护剂：常见的防冻剂有 二甲基亚砜（DMSO） 、 聚乙二醇（PEG） 、 甘油及多种糖类 等，防止细胞冰冻或解冻时引起过度脱水而遭到破坏，保护细胞。
  106. 冷冻保护剂应具有以下特性： 分子质量较小 、 易于与溶剂混合 、 快速渗入细胞 ； 无毒或毒性小 、 易洗脱 。常用的是 DMSO 。

有关名词整理

第1章 组培绪论

  1. 植物组织培养：指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体，培养在人工配制的培养基上，人为控制培养条件，使其生长、分化、增殖，发育成完整植株或生产次生代谢物质的过程和技术。狭义指由植物组织或器官培养产生愈伤组织，经过再分化进而培养成完整植株。广义指人工培养植物体一部分(即外植体) 生成完整植株。⭐
  2. 愈伤组织：原本是指植物在受伤后与其伤口表面形成的一团薄壁细胞。在植物细胞组织培养中，愈伤组织则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。特征：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。 ⭐
  3. 外植体：从植物体分离并用于离体培养的材料。⭐
  4. 植株培养：对具有完整植株形态的幼苗或较大植株进行离体培养的方法
  5. 器官培养：即离体器官的培养。根据作物和需要的不同，可以包括分离的茎尖﹑茎段﹑根尖﹑叶片﹑叶原基﹑子叶﹑花瓣﹑雄蕊﹑雌蕊﹑胚珠﹑胚﹑子房﹑果实等外植体的培养。
  6. 组织培养：是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织﹑形成层﹑木质部﹑韧皮部﹑表皮组织﹑胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过在分化诱导形成植株。
  7. 胚胎培养：对植物的胚及胚器官进行人工离体的无菌培养，使其发育成幼苗的技术
  8. 细胞培养：对植物的单个细胞或较小的细胞团进行离体培养的方法。常用的细胞培养材料有性细胞，叶肉细胞，根尖细胞等。
  9. 细胞看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
  10. 细胞平板培养：把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合，并平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。
  11. 原生质体培养：是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养
  12. 初代/诱导培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。
  13. 继代培养/增殖培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。
  14. 生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。
  15. 驯化移栽： 组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。
  16. 人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和种皮中，从而形成能发芽出苗颗粒体。
  17. 工厂化育苗：指以植物培养基为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环境条件，使细胞脱分化﹑再分化成新的组织﹑器官，进而培育出与母株一样的批量幼苗的方法。
  18. 植物激素：是指植物体内合成的，对生长发育有显著调节作用的微量小分子有机物，它们在某些组织中产生，既可以在产生它的组织中，也可运输到其它组织中发挥作用
  19. 植物生长调节剂：人工合成的具有植物激素活性的物质称为植物生长调节剂

第2章 组培基本技术

  1. 基本培养基：指只含有维持离体植物细胞基本生命活动所需的营养成分的培养基。通常包括水分、无机营养成分和有机营养成分，不包括激素和天然有机附加物。
  2. 完全培养基：指在基本培养基的基础上另外附加激素或天然有机附加物所组成的培养基。
  3. 继代培养：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。⭐
  4. 外植体：从植物体分离并用于离体培养的材料。⭐
  5. 愈伤组织培养：外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。
  6. 外植体褐变：是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。
  7. 玻璃化现象：植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状, 这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化现象，又称过度水化现象。

第3章 组培基本理论

  1. 细胞全能性理论：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。⭐
  2. 分化：分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。
  3. 脱分化：已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。
  4. 再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。

第4章 植物组织器官形成

  1. 体细胞胚(胚状体)：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。⭐

第5章 植物胚胎培养

  1. 植物胚胎培养：指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、离体受精。
  2. 胚培养：是将胚从胚珠或种子中取出，置于适宜的培养基生长；包括未成熟胚(原胚)和成熟胚两种类型的离体培养。⭐
  3. 成熟胚培养：指子叶期至发育成熟的胚培养。成熟胚是自养的，培养基需要简单。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。
  4. 幼胚培养：是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养；幼胚基本是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。
  5. 胚乳培养 ：指处于细胞期胚乳的离体培养，获得三倍体⭐
  6. 胚珠培养 ：未受精，为试管受精提供雌配子体，受精后，从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。⭐
  7. 子房培养 ：亲缘关系较远的物种杂交可获得杂种。
  8. 离体受精 ：培养未受精胚珠并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。
  9. 离体胚培养：是指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术

第7章 单倍体细胞培养

  1. 花粉培养：是从花药中分离出来的花粉粒，使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化，进而再分化并发育成完整植株的过程。⭐
  2. 花药培养：将发育到一定阶段的花药剥离下来(切去花丝部分)接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。⭐
  3. 嵌合性：指的是遗传组成不同的细胞在个体中同时存在的现象。（课本P203）⭐
  4. 单倍体：指具有配子体（gametophyte）染色体数的个体或组织，即体细胞染色体数为n。
  5. 单倍体育种：指将具有单套染色体的单倍体植物，经人工染色体加倍，使其成为纯合二倍体。从中选出具有优良性状的个体，直接繁育成新品种；或选出具有单一优良性状的个体，作为杂交育种的原理材料。

第10章 植物脱毒技术

  1. 无病毒苗：指不含该种植物的主要危害病毒，即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性反应的苗木）。能相对保持物种遗传稳定性。⭐（PPT10）

第11章 植物体细胞无性系变异及种质离体保存

  1. 体细胞无性系：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系。⭐
  2. 体细胞无性系变异：在培养阶段发生变异，进而导致再生植株亦发生遗传改变的现象。⭐
  3. 种质：是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。
  4. 植物种质资源：即为携带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。
  5. 种质资源保存：是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。
  6. 超低温保存：也叫冷冻保存，指在-196℃的液氮超低温下使细胞代谢和生长处于基本停止的状态，在适宜条件下可繁殖，再生出新的植株，并保持原来的遗传特性。

其他组培资料
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