绪论

简述植物组织培养的理论依据？

植物组织培养的理论依据是植物细胞的全能性。即植物每个细胞都携带有完整的全套遗传基因，并具有发育成完整植株的潜在能力。

植物组织培养有哪些特点？

  1. 培养条件可以人为控制。组织培养采用的植物材料完全是在人为提供的培养基和小气候环境条件下进行生长，摆脱了大自然中四季、昼夜的变化以及灾害性气候的不利影响，且条件均一，对植物生长极为有利，便于稳定地进行周年培养生产。
  2. 生长周期短，繁殖率高。植物组织培养是由于人为控制培养条件，根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比较小，往往20-30天为一个周期。
  3. 管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激素等条件，极利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。

植物组织培养的分类？

  1. 按培养对象分为：植株培养；胚胎培养；器官培养；组织培养；细胞培养；原生质体培养；
  2. 按培养过程分：初代培养；继代培养；
  3. 根据再生途径分为：愈伤组织途径；芽增殖途径；原球茎途径；体胚发生途径；
  4. 根据培养基的物理状态：固体培养；液体培养。

植物组织培养主要应用于哪些方面？

  1. 快速繁殖 运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株；
  2. 种苗脱毒 针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗；
  3. 培育和创制新品种 利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种；
  4. 大量生产次生代谢物质 通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下50多个大类，其中已有30多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。植物细胞次生物质的研制与生产硕果累累，后来居上。
  5. 植物种质资源的离体保存 植物组织培养结合超低温保存技术，可以给植物种质保存带来一次大的飞跃。因为保存一个细胞就相当于保存一粒种子，但所占的空间仅为原来的几万分之一，而且在-193度的液氮中可以长时间保存，不像种子那样需要年年更新或经常更新。
  6. 人工种子 人工种子便于贮藏和运输，适合机械化播种；繁殖速度快，不受季节和环境限制，利于工厂化生产； 体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。

组培的基本技术

论述植物生长调节物质在组织培养中的作用？ 并列举常见的种类

植物生长物质是培养基中不可缺少的关键物质，用量虽少，但它们对外植体愈伤组织的诱导和根、芽等器官分化，起着重要和关键的调节作用。
常见的种类有：

  1. 生长素类：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进细胞脱分化；促进细胞伸长；诱导根的分化，促进生根。吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）
  2. 细胞分裂素类：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长；促进细胞分裂与扩大；抑制根的分化；抑制衰老，减少叶绿素分解，有保鲜效果。激动素（KT）、异戊烯基腺嘌呤（z-iP）、6-苄基腺嘌呤（BAP、6-BA）、玉米素（Zt）、TDZ
  3. 赤霉素（GA3）
  4. 脱落酸（ABA）

常用的培养基有哪些？说明其特点

  1. MS培养基:1962年由 Murashige 和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点是无机盐离子浓度较高；
  2. white 培养基:无机机盐浓度较低，适于生根培养；
  3. N6培养基: KNO3 和(NH4) 2S04含量高，不含钼。广泛应用于禾谷类植物的花粉和花药培养；
  4. B5培养基:主要特点是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。适宜双子叶植物特别是木本植物的培养；
  5. M- -8P培养基:为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。

接种后离体培养物对光、温、湿等环境条件的要求？

  1. 光照:愈伤组织的诱导不需光照或弱光，器官分化需要光照，一般12- 16h/d，光照度1000 - 50001x;
  2. 温度：一般25士2℃
  3. 湿度:培养室内的湿度要求保持70%一80%的相对湿度。

论述离体培养污染产生的原因及防治措施。

污染：污染原因从病源分面主要有细菌和真菌和两大类。
产生原因：

  1. 外植体材料消毒不彻底
  2. 培养基灭菌不彻底
  3. 操作环境不洁净
  4. 操作人员操作不规范、不熟练。

防止措施：

  1. 减少或防止材料带菌
  2. 外植体灭菌要彻底
  3. 培养基灭菌要彻底
  4. 玻璃器皿和金属器皿的灭菌要彻底
  5. 无菌室的消毒
  6. 操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种

植物组织培养技术主要包括哪些环节？

  1. 培养基的配制及灭菌
  2. 外植体的选择及灭菌
  3. 外植体的接种及培养
  4. 试管苗的驯化与移栽

无菌操作时应注意哪些事项？

  1. 在接种4h前用甲醛熏蒸接种室;
  2. 在接种前15-20min,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯;
  3. 接种员先洗净双手，在实验前换好专用实验服;
  4. 到超净台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后用70%酒精擦拭工作台面:
  5. 接种工具蘸95%酒精，灼烧;
  6. 接种时将试管斜着，使试管口在酒精灯火焰上转动，灼烧数秒钟。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。
  7. 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等;
  8. 接种完毕后要清理干净并用酒精擦工作台。

在植物组织培养中，通过哪些途径可以得到完整的植株？

  1. 外植体→愈伤组织一根、芽→试管苗

    ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽

  2. 外植体→胚状体→试管苗

  3. 外植体→根、芽→试管苗。

基本原理

愈伤组织细胞的分化一般分几个时期？各有何特点？

  1. 诱导期：是细胞准备分裂的时期。细胞大小几不变，内部发生生理生化变化，迅速合成蛋白质和核酸。
  2. 分裂期：外层细胞分裂，中间细胞常不分裂，形成小芯。细胞分裂快，结构疏松，缺少结构，浅而透明。在原培养基上，细胞必分化，及时转移，其可无限制地进行细胞分裂，维持不分化状态。
  3. 分化期：细胞在形态和生理功能上的分化，出现形态和功能各异的细胞。

优良的愈伤组织必须具备哪4个特性？

  1. 高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物。
  2. 容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体
  3. 旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系
  4. 经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作。

愈伤组织的形态发生有哪些情况？

  1. 愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；

  2. 先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部长出根而形成小植株，多数植物属这种情况；

  3. 先产生根，再从根基部分化出芽而形成小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物少见；

  4. 先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株。

    单子叶植物：与双子叶植物诱导发生过程类似，只是在形态上无鱼雷形胚等阶段，成熟体胚上有盾片、胚芽鞘和胚根等结构。

简述细胞脱分化过程。

细胞的脱分化过程可分为3个阶段：

  1. 第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；
  2. 第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；
  3. 第三阶段是脱分化终结阶段，此时细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始

胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:

  1. 胚状体具有两极性， 即在发育的早期阶段， 从其方向相反的两端 分化出茎端和根端;而不定芽和不定根
    都为单向极性。
  2. 胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的
    维管组织相联系。
  3. 胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。而不定芽的维管组织无此现象。

胚胎培养及离体授粉

胚培养的作用有哪些？

  1. 在远缘杂交育种中的应用，克服杂种胚不能正常发育
  2. 克服珠心胚的干扰，提高育种效率
  3. 缩短育种周期
  4. 测定休眠种子的萌发率
  5. 理论研究中的应用

简述离体授粉的程序

  1. 确定开花、花药开裂及授粉时间
  2. 去雄后将花蕾套袋隔离
  3. 制备无菌子房或胚珠
  4. 制备无菌花粉
  5. 胚珠或子房的试管内授粉

胚胎培养的操作步骤

  1. 取子房
  2. 常规表面消毒
  3. 解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚
  4. 固体培养

幼胚的发育方式

  1. 胚性发育:继续进行正常的胚胎发育
  2. 早熟发育:迅速萌发成幼苗
  3. 产生愈伤组织:再分化形成多个胚状体或芽原基。

胚胎培养的意义

  1. 克服远缘杂种的不育性
  2. 使胚胎发育不完全的植株获得后代
  3. 缩短育种年限，提高育种效率

花药和花粉培养

如何确定水稻单核靠边期的花粉？

  1. 在水稻中，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。
  2. 利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。
  3. 压片染色法是检测划分发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。

比较花粉培养与花药培养

相同点：

  1. 利用小孢子染色体数目的单倍性，培育出单倍体植株。
  2. 成苗途径相同，即有 胚状体成苗 和 愈伤组织再分化成苗两条途径。

不同点：

  1. 花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。
  2. 花粉培养可避免花药壁，花丝和药隔的等体细胞组织的干扰；可计数小孢子产胚率；可观察和更好调节控制雄核发育的全过程；花粉量大，具有单细胞，单倍性和较高的同步性。但技术更复杂。

简述花粉分离方法

  1. 自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将 花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。
  2. 挤压法在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。
  3. 机械游离
    • 磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来;
    • 超速旋切法通过搅拌器 中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来

细胞培养

如何得到单细胞无性系？

在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可以用机械法和酶解法从植物器官直接制备单细胞。
由分离的单细胞经看护培养法、微室培养法或平板培养法，即可得到单细胞无性系。

单细胞培养有哪些方法？各有何含义及特点

单细胞培养：看护培养；微室培养；平板培养

  1. 看护培养法：指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
    特点：优点：①简便易行 ②效果好，易于成功。
    缺点：不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
    用途：诱导形成单细胞系。
  2. 微室培养法：即将细胞培养在很少量的培养基中。
    特点：优点：在培养过程中，可以连续进行显微观察一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程
    缺点：培养时间较短
    用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
  3. 平板培养法：把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方法。
    特点：优点：①可以定点观察;②分离单细胞系容易;
    缺点：培养细胞气体交换不畅。
    用途：分离单细胞无性系，研究其生理、生化、遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。

什么是植板率？小细胞团的计数方法有哪几种？

植板率是指已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数。
小细胞团计数方法:

  1. 低倍显微镜直接计算;
  2. 细胞团显影法

什么是细胞悬浮培养？简述成批培养和连续培养的的特点？

细胞悬浮培养:是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。

  1. 成批培养的特点:
    • 细胞生长在固定体积的培养基上，直至养分耗尽；
    • 用搅拌的方法使细胞团和细胞均匀分布；
    • 细胞数目呈现慢-快一慢一停止生长的变化，但必须更换新鲜培养基才能进行下一批培养。
  2. 连续培养的特点:
    • 由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象；
    • 可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快；
    • 适于大规模工业化生产。

细胞悬浮培养主要应用

  1. 植物有用物质的生产：在植物组织培养研究中，发现培养细胞中含有各种特殊的代谢产物。
  2. 诱发和筛选突变体：在细胞培养过程中会产生一些突变体，常采用不同培养基来进行选择，也就是把悬浮细胞培养于缺少某种营养物质或生长因子，或是添加某种抑制剂的培养基里，使突变细胞和正常细胞区别开来
  3. 原生质体培养和细胞分离：利用细胞悬浮培养方法，对细胞原生质进行分离，在适宜的培养基上进行培养，使之生成完整植株，或对原生体的生理特性进行观察研究。
  4. 食品生产：通过对许多食用植物培养组织的细胞团生产的研究。

原生质体培养和细胞融合

简述原生质体作为遗传操作和生理生化研究的材料有何特点？

  1. 没有细胞壁，有利于体细胞融合、体细胞杂交、基因转移和单细胞培养。
  2. 原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质。

酶法分离原生质体时使用的酶的种类有哪些？

常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等。

简述一步酶法分离原生质体的方法

一步分离法:把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理而分离出原生质体。处理温度25-30℃，处理的时间根据材料及酶浓度的不同而不同，可为2-24h。

如何纯化分离的植物原生质体并鉴定其活力？

  1. 原生质体的纯化
    • 沉降法：应用原生质体的比重大于溶液的性质而使原生质体沉于底部。
    • 漂浮法：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮于液体表面。
    • 梯度离心法：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。
  2. 原生质体活力的测定
    • 形态识别:形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。
    • 染色识别
      1. 0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。
      2. 双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。

原生质体培养的方法有哪些？

  1. 液体浅层培养
  2. 平板法培养
  3. 微悬滴法培养
  4. 双层培养法
  5. 饲养层培养

原生质体融合有哪几种主要方法？

  1. 化学法诱导融合:硝酸盐溶液
  2. PEG结合高钙-高pH诱导法:在无菌条件下混合双亲原生质体——滴加PEG溶液，摇匀，静置一—滴加高钙高pH溶液，摇匀，静置——滴加原生质体培养液洗涤数次——离心获得原生质体细胞团——筛选——再生杂合细胞。
  3. 电融合技术:将双亲原生质体悬浮溶液混合后插入微电极，接通一定的交变电场，原生质体极化后顺着电场排列成珠状，此时施与适当强度的电脉冲，使原生质体膜被击穿而发生融合。

植物离体快繁和人工种子

人工种子的优点。

  1. 使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快速繁殖和保存；
  2. 繁殖速度快；
  3. 为基因工程技术应用于生产提供桥梁；
  4. 固定杂种优势；
  5. 提高植物抗逆性；
  6. 取代天然种子，节约粮食。
  • 人工种子与试管苗相比，具有所用培养基量少、体积小、繁殖快、发芽成苗快、运输及保存方便的特点;
  • 人工种子技术适用于难以保存的种质资源、遗传性状不稳定或育性不佳的珍稀林木繁殖;
  • 人工种子可以克服营养繁殖造成的病毒积累，可以快速繁殖脱毒苗。

植物无病毒苗木培育

植物脱毒的主要方法有哪些？其主要原理是什么？

  1. 茎尖培养脱毒:病毒在植物体内的分布并不均匀，越靠近茎端的病毒的感染深度越低，生长点则几乎不含或含病毒很少
  2. 愈伤组织培养脱毒法:通过植物的器官和组织的培养，脱分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗
  3. 珠心胚培养脱毒:病毒一般不通过种子传播，由珠心细胞发育成的胚再生的植株是无毒的，并具有与母本相:同的遗传特性。
  4. 茎尖微体嫁接:将实生苗砧木在人工培养基上种植培育，再从成年无病树枝上切取0.4- -1.0mm茎尖，在砧木上进行试管 微体嫁接，以获得无病毒幼苗。
  5. 热处理脱毒:一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下(35-40C)，即钝化失活(6)化学处理脱毒:抑制或杀死病毒
  6. 化学处理脱毒：抑制或杀死病毒

说明微尖嫁接技术脱毒的程序

微尖嫁接技术指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖以培养脱毒苗的技术。
主要程序:无菌砧木培养——茎尖准备——嫁接——嫁接苗培养——移栽。

目前鉴定脱毒苗的方法有哪些？各有何特点？

  1. 指示植物法:将一些对病毒反应敏感、症状特征显著的植物作为指示植物(又称鉴别寄主)，利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法。这种方法条件简单，操作方便，为一种经济而有效的鉴定方法
  2. 抗血清鉴定法:用已知抗血清鉴定未知病毒的种类。这种方法特异性高，测定速度快。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。
  3. 电镜检查法:可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和结构，又可以鉴定病毒的种类。优点是方法先进、灵敏度高、能在植物粗提取液中定量测定病毒。但需一定的设备和技术。

简述植物无病毒原种长期保存的方法。

  1. 低温保存:将茎尖或小植株接种到培养基上，置低温(1-9℃)、低光照下保存。材料生长极缓慢，只需半年或一年更换一次培养基，又叫最小生长法。
  2. 冷冻保存(又叫超低温保存)，一般用液氮保存植物材料。在—169℃的低温下，植物材料新陈代谢活动基本停止，处于“生机停顿”状态。

植物脱毒的意义

  1. 能够有效地保持优良品种的特性
  2. 快速繁殖品种，使优良品种迅速应用
  3. 生产无病毒种苗，防止品种退化
  4. 节约耕地，提高农产品的商品率
  5. 便于运输

种质保存

低温保存和超低温保存技术冷冻的方法

  • 快速冷冻法
  • 冷冻前的预处理
  • 解冻方法
  • 重新培养

冷冻保存的应用前景

  1. 长期保存种质的遗传稳定性。
  2. 长期保存去病毒的种质。
  3. 保持稀有珍贵及濒危植物的种质资源。
  4. 保持不稳定性的培养物，如单倍体。
  5. 保持培养细胞形态发生的能力。
  6. 防止种质衰老。
  7. 延长花粉寿命，解决不同开花期和异地植物杂交上的困难。
  8. 冷冻解冻过程可筛选抗逆新品种。
  9. 便于国际间的种质交换。